Consigli HILIC, parte 5 Regolare correttamente i sali per la fase HILIC mobile

L'aggiunta di sale alla fase mobile HILIC migliora la riproducibilità e la forma dei picchi, ottimizzando così la qualità della separazione. Ma quali sono i sali più adatti? Come si possono dissolvere in modo affidabile in fasi mobili con un’elevata percentuale di acetonitrile? E quale influenza hanno i sali sulla separazione?

In genere, alla fase mobile vengono aggiunti dei sali per poter controllare le interazioni elettrostatiche tra gli analiti carichi e la fase stazionaria. Ciò migliora la forma dei picchi degli analiti eluiti, riducendo il tailing dei picchi. A questo proposito, occorre tenere presente alcuni aspetti.

Sali adatti per la tecnica HILIC

Normalmente, nella HILIC vengono utilizzati sali come acetato di ammonio e formiato di ammonio, talvolta anche bicarbonato di ammonio (cfr. fig. 2). È interessante notare che questi sali si dissolvono anche in miscele di solventi con un elevato contenuto di acetonitrile, come avviene tipicamente nell’HILIC all’inizio delle analisi. Allo stesso tempo, grazie alla loro volatilità, questi sali sono compatibili con la successiva rilevazione mediante spettrometria di massa, che rappresenta una tecnica di rilevazione ampiamente utilizzata per l’HILIC. L’uso di sali meno solubili, come i fosfati, o di reagenti a coppia ionica, come il TFA, dovrebbe essere evitato, se possibile, qualora si preveda la rilevazione MS. Tuttavia, se si utilizzano rivelatori spettroscopici, è possibile impiegare anche sali “non volatili”. Tali sostanze presentano in misura maggiore i cosiddetti effetti di salificazione e possono avere effetti cosmotropici e caotropici sulle molecole cariche, ovvero rafforzare o interferire con i legami a ponte idrogeno [1]. Questo argomento, tuttavia, andrebbe troppo oltre in questa sede e può essere approfondito nei lavori di Andrew J. Alpert.

La maggior parte delle fasi mobili HILIC viene quindi preparata con l'aggiunta di acetato di ammonio o formiato di ammonio. Questi due sali non sono intercambiabili, poiché il formiato di ammonio determina un valore di pH più acido nella fase mobile rispetto all'acetato di ammonio.

Una miscela dei due sali consente di regolare in modo mirato il valore del pH della fase mobile entro un determinato intervallo.

Influenza della salinità

L'effetto fondamentale della concentrazione salina nella fase mobile può essere descritto come segue: I sali influenzano le interazioni elettrostatiche delle molecole cariche con i materiali delle colonne carichi o zimmerionici (vedi Consiglio HILIC n. 3). In caso di attrazione elettrostatica tra analiti e fase stazionaria, vale quanto segue: l’aumento della salinità comporta una riduzione della ritenzione.

Di conseguenza, nel caso di repulsione elettrostatica tra gli analiti e la fase stazionaria, vale il contrario: l’aumento della concentrazione salina comporta una maggiore ritenzione dell’analita corrispondente.

Il secondo effetto derivante dall’uso di sali o dall’aumento della concentrazione salina nella fase mobile si manifesta nello spessore dello strato d’acqua sulla superficie dei materiali HILIC polari. L'elevato contenuto di solvente organico nella fase mobile all'inizio di una separazione induce il sale ad accumularsi preferenzialmente nello strato d'acqua. Una crescente concentrazione di sale porta quindi a un aumento dello spessore dello strato d'acqua, il che in linea di principio comporta una maggiore ritenzione di tutti gli analiti polari (eccezione: vedi sopra). Pertanto, un contenuto significativo di sale porta a una maggiore ritenzione anche per gli analiti polari non caricati, anche se questi non sono in grado di formare interazioni elettrostatiche. Uno schema esplicativo al riguardo è riportato nella Figura 2. I lavori alla base di questo studio sono stati da noi condotti circa 15 anni fa sulla fase ZIC-HILIC e pubblicati in un articolo [2].

Preparazione della fase mobile

Per garantire un’adeguata riproducibilità della ritenzione e della forma dei picchi, è necessario che la fase mobile presenti una concentrazione finale di sali pari ad almeno 5 mmol/L e che tale concentrazione venga mantenuta stabile nel tempo. Abbiamo già discusso altrove gli effetti di un gradiente salino e non ne terremo conto in questa sede [3]. La solubilità dei sali nella fase mobile con un’elevata percentuale di solvente organico può tuttavia rivelarsi problematica e spesso porta alla precipitazione dei sali nella soluzione.

Nel caso di fasi mobili con una percentuale di acetonitrile pari al 95%, la concentrazione di sale dovrebbe essere inizialmente mantenuta al di sotto dei 15 mmol/L a causa della limitata solubilità.

Nella Figura 3 è illustrata una procedura convenzionale per la preparazione di fasi mobili per la HILIC. A titolo di esempio, si preparerà 1 L di una fase mobile composta da acetonitrile/acqua (95:5, v/v) con una concentrazione finale di acetato di ammonio pari a 10 mmol/L. È fondamentale che l’acetato di ammonio venga dapprima disciolto completamente in acqua pura. A tal fine, si preparano innanzitutto 50 mL di una soluzione acquosa di acetato di ammonio con una concentrazione di 200 mmol/L. Con una semplice agitazione, il sale si dissolve completamente nell’acqua in pochi secondi. Successivamente, sotto continua agitazione, si aggiungono lentamente 950 mL di acetonitrile ai 50 mL di soluzione acquosa di acetato di ammonio. In questo modo si ottiene 1 L di fase mobile con un rapporto acetonitrile/acqua di 95:5 (v/v) e una concentrazione finale di acetato di ammonio pari a 10 mmol/L.

La soluzione finale può ora presentare piccole sfere torbide sul fondo della bottiglia. Ciò indica una soluzione non perfetta del sale nella fase mobile. L’uso di bottiglie di vetro trasparente può aiutare a monitorare questo effetto. Agitare energicamente, magari anche per tutta la notte, non migliorerà la solubilità del sale. Per portare il sale in soluzione completa, tuttavia, è opportuno sottoporre la bottiglia contenente la soluzione a un bagno a ultrasuoni fino a quando la soluzione non diventa trasparente e le goccioline o le particelle non sono scomparse. Di norma, un trattamento di 30 minuti è più che sufficiente.

Non appena il sale si è completamente sciolto, la fase mobile può essere filtrata come di consueto e risulta quindi immediatamente disponibile per l’applicazione cromatografica. Questa procedura può essere applicata anche ad altre fasi mobili HILIC e, se necessario, modificata. Il contenuto d’acqua, il tipo di sale e la concentrazione salina possono essere adattati in modo mirato alla rispettiva applicazione. È inoltre importante che il trattamento a ultrasuoni sia riproducibile. In particolare, l’intensità e la durata della sonificazione dovrebbero essere mantenute sempre costanti.

Effetto della salinità

Oltre a influire sulle interazioni elettrostatiche, la concentrazione salina incide sullo spessore dello strato acquoso, compromettendo così anche la ritenzione dei composti non caricati. Un’elevata percentuale di solvente organico nell’eluente fa sì che il sale venga spinto preferenzialmente nello strato acquoso. Un aumento della concentrazione salina porta quindi inevitabilmente a uno strato acquoso più spesso. Questo duplice effetto della concentrazione salina è osservabile in alcune separazioni. Esempio:

Separazione dell'acido 2-idrossibenzoico e dell'acido 4-idrossibenzoico (2-HB e 4-HB; contrassegnati nella Figura 4 come n. 1 e n. 2) su tre colonne con proprietà diverse (come mostrato nella Figura 4 e tratto dall'originale [3]). A pH neutro, entrambi gli analiti si trovano nel loro stato caricato negativamente a seguito della deprotonazione del gruppo carbossilico. Un aumento della concentrazione di acetato di ammonio da 10 mM a 15 mM, mantenendo una percentuale costante del 90% di acetonitrile nella fase mobile, determina per il 4-HB un netto rafforzamento del suo legame con la colonna di diolo neutro e un tempo di ritenzione più elevato.

Nota: il 2-HB presenta un legame a ponte idrogeno intramolecolare tra il gruppo carbossilico e quello idrossilico [5], per cui questa molecola si comporta cromatograficamente in modo molto “non polare” (come ad esempio il toluene) e non subisce quindi alcun ritardo su una colonna HILIC neutra.

Tornando alla separazione polare: l’evidente aumento della ritenzione a maggiore salinità, dovuto allo strato d’acqua più spesso, è chiaramente visibile per il 4-HB, soprattutto nelle fasi neutre.

L’influenza della concentrazione salina sulla ritenzione è inoltre attribuita a un effetto di salificazione [1]. In questo caso, le molecole d’acqua vengono legate in misura maggiore alla solvatazione degli ioni salini, il che riduce la solvatazione degli analiti e può favorire le loro interazioni dirette con la fase stazionaria. Nel caso della fase amminica caricata positivamente, si osserva un’attrazione elettrostatica con entrambe le molecole, ovvero con gli anioni 2-HB e 4-HB (nel caso di quest’ultimo, notevolmente più marcata a causa dell’idrofilia). Un aumento della concentrazione salina provoca una diminuzione dell’attrazione elettrostatica con una conseguente riduzione della ritenzione.

Come già illustrato, nelle fasi stazionarie zwitterioniche il gruppo cationico interno determina un’attrazione elettrostatica verso analiti con carica negativa, quali il 2-HB e il 4-HB. Allo stesso tempo, questi analiti subiscono una repulsione elettrostatica da parte del gruppo anionico esterno della fase stazionaria. Tuttavia, queste forze non sono predominanti, poiché l’effetto principale in questo caso non è l’interazione elettrostatica, bensì, in primo luogo, il maggiore spessore dello strato d’acqua in presenza di una maggiore concentrazione salina.

Nel prossimo consiglio HILIC ci occuperemo degli effetti combinati dei prodotti biologici e del sale.

Bibliografia

[1] A.J. Alpert: Effetto dei sali sulla ritenzione nella cromatografia a interazione idrofila. Journal of Chromatography A 2018, 1538, 45-53

[2] G. Greco, S. Grosse e T. Letzel: Studio del comportamento di ritenzione nella cromatografia a interazione idrofila zwitterionica degli acidi idrossibenzoici e aminobenzoici isomerici. Journal of Chromatography A 2012, 1235, 60-67.

[3] T. Letzel: Specifiche dei gradienti nella cromatografia liquida a interazione idrofila (HILIC). In: HPLC a gradiente per professionisti: RP, LC-MS, analisi ionica, biochromatografia, SFC, HILIC. Stavros Kromidas (a cura di) Wiley-VCH; ISBN-10: 352734408X; 1ª edizione (17 aprile 2019), pagg. 175-182

[4] G. Greco e T. Letzel: Principali interazioni e influenze dei parametri cromatografici nelle separazioni HILIC. Journal of Chromatographic Science, 2013, 51 (7), 684-693.

[5] S. Grosse e T. Letzel: Cromatografia liquida / spettrometria di massa a ionizzazione a pressione atmosferica con miscelazione liquida post-colonna per la determinazione efficiente di idrocarburi policiclici aromatici parzialmente ossidati. Journal of Chromatography A 2007, 1139, 75-83.

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Gli autori

Dr. Thomas Letzel: Fondatore e amministratore delegato, Analytisches Forschungsinstitut für Non-Target Screening GmbH (AFIN-TS), www.afin-ts.de

Thomas Letzel ha seguito una formazione come tecnico di laboratorio chimico, ha poi studiato chimica e ha conseguito il dottorato in analisi ambientale. Successivamente ha svolto soggiorni di ricerca analitica ad Amsterdam e a Monaco di Baviera (presso la TUM, dove dal 2009 insegna anche come libero docente di «Chimica analitica e bioanalitica»). Dal 2018 svolge attività di ricerca e consulenza (come membro del trio di fondatori) con il proprio istituto di ricerca e si è posto l’obiettivo di integrare maggiormente l’HILIC come metodo HPLC nella pratica analitica quotidiana.

Dott. Stefan Bieber: Fondatore e amministratore delegato, Analytisches Forschungsinstitut für Non-Target Screening GmbH (AFIN-TS)

Insieme a Thomas Letzel, Stefan Bieber dirige la AFIN-TS GmbH in qualità di amministratore delegato e si occupa da molti anni di screening non mirato.


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Dott.ssa Annette Dibowski:Amministratrice delegata, Dichrom GmbH, www.dichrom.com

Annette Dibowski non è solo amministratrice delegata di Dichrom e consulente commerciale presso Biotech Fluidics, ma anche un’appassionata “ricercatrice polare” nel campo della cromatografia dei composti polari.

Altre informazioni su HILIC

I consigli HILIC sono gentilmente forniti dal dott. Thomas Letzel e dal suo team. Questa serie di articoli ha lo scopo di superare i timori nei confronti di questo metodo e di illustrarne le potenzialità analitiche. Nel corso del 2026 e del 2027 seguiranno ulteriori articoli.

Per domande relative a HILIC , non esitate a contattare direttamente i responsabili di questi consigli tramite il loro sito web: 
www.afin-ts.de (Dr. Thomas Letzel e Dr. Stefan Bieber) e www.dichrom.com (Dr. Annette Dibowski)