L'ionizzazione DBDI come ponte tra GC e LC-MS Analisi dei pesticidi senza compromessi: 687 pesticidi in 15 minuti

I metodi GC-MS tradizionali raggiungono i propri limiti in presenza di matrici complesse e di elenchi di composti sempre più estesi. Una sorgente ionica basata sulla tecnologia DBDI genera ioni molecolari intatti anziché frammenti, aprendo così la strada a flussi di lavoro più semplici, alla conferma MS/MS e a librerie di spettri condivise con LC-MS/MS.

La gascromatografia-spettrometria di massa (GC-MS) fa parte da decenni del repertorio standard dell’analisi dei residui di pesticidi. I suoi punti di forza sono noti: elevata capacità di separazione, riproducibilità, quantificazione affidabile e un’ampia base di dati grazie a librerie di spettri consolidate. Meno discusso è invece ciò che il metodo di ionizzazione prevalente – la ionizzazione a impatto elettronico (EI) – impedisce sistematicamente in questo contesto.

Quando gli spettri dei frammenti non sono più sufficienti

Nella ionizzazione EI, le molecole dell’analita vengono esposte a elettroni ad alta energia. Il risultato è una frammentazione estesa: lo ione molecolare intatto viene distrutto, mentre rimane una serie di 10-20 picchi di frammenti nella fascia di massa bassa. In matrici pure con concentrazioni elevate ciò è sufficiente. Nei campioni reali, come ad esempio estratti alimentari, matrici ambientali e materiali agricoli complessi, questi ioni frammentati entrano in competizione con i segnali della matrice nelle stesse regioni dello spettro.

Le conseguenze: maggiore onere di analisi manuale nell’identificazione dei picchi, selettività limitata in presenza di concentrazioni in tracce vicine al limite massimo di residui (LMR). A complicare ulteriormente la situazione, le disposizioni normative per determinate sostanze richiedono almeno due punti di identificazione: nel caso della GC-EI, oltre al cromatogramma, tipicamente tramite ioni frammentari caratteristici nella modalità Selected Ion Monitoring (SIM). Se la modalità SIM non è possibile o non è univoca, diventa necessario un secondo ciclo di misurazione su una piattaforma LC-MS/MS (cromatografia liquida-spettrometria di massa): con una nuova preparazione del campione, spesso complessa da adattare, e talvolta senza risultati utilizzabili per analiti volatili o termolabili, poiché questi semplicemente non possono essere ionizzati nelle condizioni di ionizzazione a elettrospray (ESI) normalmente associate alla LC-MS.

Il risultato: due ecosistemi di dispositivi distinti, due formati di librerie spettrali e due processi di sviluppo metodologico – con un doppio onere in termini di approvvigionamento, manutenzione e formazione.

La ionizzazione morbida come ponte tra GC e LC

È proprio qui che entra in gioco una sorgente ionica basata sulla DBDI. DBDI sta per “scarica a barriera dielettrica” – un principio di ionizzazione che ionizza gli analiti in modo “morbido”, riducendone quindi la frammentazione. Il risultato sono spettri dominati da ioni molecolari e quasi-molecolari intatti: prevalentemente [M+H]⁺ e [M]⁺. Mentre la modalità EI distribuisce l’intensità del segnale su 10-20 picchi di frammentazione, la sorgente ionica DBDI concentra il segnale in una o due specie ioniche dominanti.

Plasmion ha commercializzato questa tecnologia con il nome di Sicrit. Un vantaggio architettonico fondamentale: grazie a moduli di accoppiamento dedicati, la stessa sorgente ionica può collegare a scelta una separazione GC o una separazione LC allo stesso spettrometro di massa. Le analisi GC e LC continuano a essere eseguite come cicli separati, ma condividono la stessa chimica ionica, la stessa libreria spettrale e lo stesso flusso di lavoro di conferma. Inoltre, la sorgente ionica è in grado di ionizzare sia componenti polari che non polari, superando così in parte il tradizionale confine tra l’analisi basata su GC e quella basata su LC. Non è vincolata a un determinato produttore di apparecchiature, ma può essere combinata con tutti i sistemi cromatografici disponibili in commercio (GC, LC, SFC) e con uno spettrometro di massa a pressione atmosferica.

Limiti di rilevabilità normativi in modalità Full Scan

Il fatto che la sorgente ionica fornisca ioni molecolari intatti e possa essere combinata con entrambe le piattaforme di separazione costituisce la base tecnica; tuttavia, la questione fondamentale per l’impiego in laboratorio è: la sensibilità è sufficiente per i limiti di rilevabilità (LOD) rilevanti dal punto di vista normativo? I LOD per i pesticidi devono raggiungere o essere inferiori al valore massimo standard dell’UE di 10 ppb, idealmente senza dover ricorrere a modalità di acquisizione mirate come SIM o Multiple Reaction Monitoring (MRM).

In uno studio condotto con una configurazione GC-DBDI-LC-QTOF, sono stati analizzati 74 pesticidi provenienti da tre standard multiresiduali su un intervallo di calibrazione a cinque punti compreso tra 1 ppb e 1 ppm. I LOD sono stati calcolati secondo la metodologia della Commissione europea (3,9 × Sb / pendenza; Sb = deviazione standard). Tutte le misurazioni sono state effettuate in modalità Full-Scan-MS¹ – senza SIM, senza MRM, senza ottimizzazione specifica per il composto.

Il risultato: 70 dei 74 composti hanno raggiunto LOD inferiori al valore massimo standard dell’UE di 10 ppb. Le curve di calibrazione hanno mostrato una forte linearità su tutti e tre gli standard. Raggiungere limiti di rilevabilità rilevanti dal punto di vista normativo in modalità full-scan non mirata non è un risultato banale: ciò dimostra il potenziale di ottimizzazione di questo metodo per l’impiego mirato con altre modalità (SIM, MRM) o, più in generale, su sistemi a triplo quadrupolo (MRM).

Conferma MS/MS direttamente dall'analisi GC

Una sensibilità adeguata è il primo requisito per l’impiego a fini normativi; il secondo è l’identificazione inequivocabile di un risultato positivo. È proprio qui che emerge un ulteriore vantaggio degli ioni precursori intatti: con uno ione precursore [M+H]⁺ dominante, il flusso di lavoro di conferma risulta notevolmente semplificato. L’acquisizione dipendente dai dati (DDA) può innescare automaticamente la frammentazione indotta da collisione (CID) per i composti di interesse. Gli spettri MS² risultanti derivano da uno ione precursore chiaramente definito a energie di collisione controllate – lo stesso quadro sperimentale utilizzato per la conferma LC-MS/MS.

Poiché gli ioni precursori generati sono chimicamente equivalenti a quelli prodotti dall’ESI, gli spettri MS² ottenuti dalle acquisizioni GC-DBDI possono essere confrontati direttamente con le librerie di spettri LC-MS/MS esistenti, senza necessità di conversione o adattamento. Per il diazinon, ad esempio, lo spettro MS² corrispondeva alla voce della libreria LC-MS/MS di Shimadzu come risultato principale.

Copertura del laboratorio di chimica

Dopo aver dimostrato la sensibilità e la capacità di conferma su un insieme ridotto di composti, è sorta la domanda: fino a che punto questo approccio sia scalabile – e quale porzione dello spazio dei composti rilevanti possa effettivamente essere coperta da un unico metodo. I metodi GC e LC hanno tradizionalmente suddiviso questo spazio in base alle proprietà chimiche: composti non polari volatili e semivolatili per la GC, composti polari e termolabili per la LC. Molti elenchi di pesticidi contengono composti appartenenti a entrambe le categorie – e nessuna piattaforma convenzionale singola è in grado di coprirli entrambi.

Questa questione è stata esaminata, tra l’altro, in uno studio condotto nell’ambito di un progetto di dottorato presso l’Università Tecnica di Monaco di Baviera utilizzando la stessa configurazione GC-DBDI-LC-QTOF. Sono stati analizzati 687 pesticidi, appartenenti a classi di composti adatti sia alla GC che alla LC, di cui già nel primo esperimento, senza alcuna ottimizzazione, è stato possibile rilevarne il 99,1%. È degno di nota il fatto che anche i composti tradizionalmente adatti alla LC siano stati rilevati tramite separazione GC senza alcuna derivatizzazione – ciò è stato possibile poiché l’ionizzazione DBDI non è limitata ad analiti polari o apolari. L’intervallo dinamico lineare ha superato i tre ordini di grandezza e la sensibilità ha soddisfatto i valori soglia MRL dell’UE per tutti i composti rilevati. L’uso dell’idrogeno al posto dell’elio come gas vettore ha ridotto il tempo di analisi di circa il 40% a 15 minuti, mantenendo la stessa risoluzione cromatografica e senza effetti negativi sulle prestazioni della spettrometria di massa o sulla qualità degli spettri.

Cosa significa questo per la quotidianità del laboratorio

I vantaggi analitici hanno una diretta implicazione a livello di infrastruttura. Un laboratorio convenzionale che utilizza GC-MS e LC-MS come piattaforme separate gestisce due ecosistemi di apparecchiature indipendenti: due spettrometri di massa, due sorgenti di ionizzazione, due formati di librerie spettrali, due flussi di lavoro per lo sviluppo dei metodi.

Grazie a una sorgente ionica comune per GC e LC, entrambi i metodi di separazione condividono la stessa chimica ionica, la stessa libreria di spettri e lo stesso flusso di lavoro di conferma. Ciò non rende obsoleti il GC-EI e l’LC-ESI: continueranno ad esserci applicazioni che richiedono specificamente modelli di frammentazione EI per l’identificazione, oppure l’ESI per composti che non tollerano la separazione GC. Ciò che sta emergendo è una terza categoria: applicazioni in cui un unico approccio di ionizzazione copre entrambi gli spazi di composti su un'unica piattaforma MS.

Proprio per questa terza categoria, l’onere descritto all’inizio in termini di infrastrutture e processi si riduce sensibilmente: una sola piattaforma hardware anziché due, una libreria di spettri comune, meno duplicazioni nello sviluppo dei metodi e minori costi di manutenzione e formazione.

Conclusione

La ionizzazione morbida, in combinazione con la GC, non solo modifica la qualità dello spettro, ma crea anche i presupposti per un flusso di lavoro analitico radicalmente diverso. La sorgente ionica basata su DBDI genera spettri dominati da ioni molecolari e quasi-molecolari intatti, con limiti di rilevabilità che superano addirittura quelli delle attuali tecniche GC-MS per molte sostanze, e consente la conferma MS/MS tramite il confronto diretto con le librerie LC-MS/MS. Per i laboratori che finora hanno gestito GC-MS e LC-MS come due mondi separati, la DBDI apre così la strada per superare questo confine senza rinunciare alla profondità analitica di nessuno dei due metodi.