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Cromatografia liquida miniaturizzata Finalmente in miniatura: come la stampa 3D riduce le dimensioni dell’HPLC

Un articolo a cura di Dr. Thorsten Teutenberg et al. (vedi informazioni sugli autori alla fine dell'articolo) | Tradotto dall'IA 7 min Temps de lecture

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Institut für Energie und Umweltechnik e.V.

HPLC, ma in formato mini. Grazie al ridotto fabbisogno di solvente, questa tecnica è più sostenibile ed economica, ma nonostante ciò è ancora poco diffusa. Gli ostacoli tecnologici sono troppo elevati. Le fasi stazionarie realizzate con la stampa 3D potrebbero ora spianare la strada a sistemi lab-on-chip interamente stampati, dando così nuovo slancio alla micro e nano-LC.

Fig. 1: Nell'ambito di un progetto di ricerca, sono state stampate delle microcolonne per la cromatografia liquida mediante litografia a due fotoni.(Immagine: Università di Reutlingen)
Fig. 1: Nell'ambito di un progetto di ricerca, sono state stampate delle microcolonne per la cromatografia liquida mediante litografia a due fotoni.
(Immagine: Università di Reutlingen)

Da anni la miniaturizzazione è una delle principali tendenze di sviluppo nell’analisi strumentale. I sistemi più piccoli richiedono meno solventi e materiale campione, consentono tempi di analisi più brevi e aprono la strada a nuove applicazioni, dall’analisi di processo ai sistemi portatili “lab-on-chip”. Mentre la microfluidica si è affermata in molti settori, lo sviluppo di colonne di separazione cromatografica miniaturizzate ad alte prestazionirappresenta ancora oggi una sfida tecnologica.

Il progetto di ricerca 3DmiChrom della Ricerca Industriale Collettiva (IGF) ha quindi adottato un nuovo approccio: anziché utilizzare colonne impacchettate in modo convenzionale, gli scienziati realizzano fasi stazionarie direttamente in tre dimensioni mediante polimerizzazione a due fotoni (2PP). Questo processo di produzione additiva, che attualmente offre la massima risoluzione, consente di ottenere dimensioni strutturali nell’ordine dei micrometri e dei submicrometri, aprendo così nuovi orizzonti nella produzione di monoliti cromatografici.

Miniaturizzazione delle colonne: quali sono gli ostacoli?

I vantaggi della cromatografia liquida miniaturizzata sono noti da tempo [1-3]. Un minore consumo di solventi riduce i costi operativi e l’impatto ambientale. Allo stesso tempo, i tempi di analisi sono più brevi, il che rende più redditizia la realizzazione, in particolare, di applicazioni ad alta produttività. Ciononostante, i sistemi LC microfluidici hanno avuto finora un successo limitato, sia in ambito accademico che industriale.

Uno dei motivi principali della lenta diffusione della micro- e nano-HPLC è l’estrema difficoltà nel riempire in modo riproducibile le colonne necessarie. Solo pochi produttori di colonne hanno nel proprio portafoglio prodotti fasi di separazione con un diametro interno < 1 mm.

Fasi stazionarie dalla stampante 3D

Al centro del progetto di ricerca congiunto tra l’Università di Reutlingen e l’Istituto per l’Ambiente e l’Energia, la Tecnologia e l’Analitica e. V. (IUTA) era quindi lo sviluppo di monoliti polimerici realizzati con la stampa 3D a base di 2PP: In questo processo, una resina liquida viene indurita esclusivamente nei punti in cui le molecole assorbono contemporaneamente due fotoni [4-5].

All’inizio del progetto, i partner hanno individuato le resine fotoresistenti idonee e le hanno successivamente perfezionate appositamente per le applicazioni cromatografiche. Poiché i materiali disponibili in commercio non soddisfacevano i requisiti di funzionalità chimica e resistenza, sono state sviluppate formulazioni di resina proprietarie per fasi stazionarie idrofile, idrofobe e ioniche. Si sono rivelate particolarmente efficaci le formulazioni a base di 2-idrossietilmetacrilato (HEMA) e laurilmetacrilato (LMA), che hanno dimostrato sia un’elevata stabilità chimica sia una buona funzionalizzazione.

Struttura porosa controllata digitalmente

Il vero progresso risiede tuttavia nella progettazione strutturale dei monoliti. Mentre i monoliti convenzionali ottengono la loro struttura porosa prevalentemente attraverso processi di polimerizzazione [6], questa nel 2PP viene definita interamente in modo digitale.

Fig. 2: Immagini al microscopio elettronico a scansione (SEM) dei monoliti polimerici di diverse geometrie realizzati con la tecnologia di produzione additiva 2PP. a) Struttura ottaedrica; b) struttura tetraedrica; c) struttura sferica e d) struttura giroide.(Bild: Università di Reutlingen)
Fig. 2: Immagini al microscopio elettronico a scansione (SEM) dei monoliti polimerici di diverse geometrie realizzati con la tecnologia di produzione additiva 2PP. a) Struttura ottaedrica; b) struttura tetraedrica; c) struttura sferica e d) struttura giroide.
(Bild: Università di Reutlingen)

Grazie a modelli parametrici di progettazione assistita da computer (modelli CAD) è stato possibile studiare diverse geometrie (vedi fig. 2). Oltre alle strutture a forma di ottaedro, tetraedro e sfera, la geometria giroide si è rivelata particolarmente adatta. Questa struttura TPMS (Triply Periodic Minimal Surface) combina un’elevata stabilità meccanica con un sistema di pori macropore ottimamente interconnesso e proprietà di flusso favorevoli. Le simulazioni di fluidodinamica hanno fornito ulteriori informazioni per futuri miglioramenti della struttura tridimensionale.

Macropori riproducibili fino a 1 µm

Fig. 3: Flusso di lavoro per la produzione di una colonna di separazione monolitica realizzata con la tecnologia di produzione additiva 2PP.(Bild: Università di Reutlingen)
Fig. 3: Flusso di lavoro per la produzione di una colonna di separazione monolitica realizzata con la tecnologia di produzione additiva 2PP.
(Bild: Università di Reutlingen)

Uno dei risultati principali del progetto è stata la produzione riproducibile di sistemi a macropori aperti con diametri dei pori fino a 1 µm. A tal fine, non è stato determinante solo il processo di stampa, ma soprattutto un trattamento post-produzione ottimizzato delle fasi stazionarie realizzate. Dopo la stampa, infatti, è necessario rimuovere completamente la resina fotosensibile in eccesso dalle complesse reti porose. A tal fine, i ricercatori hanno sviluppato un processo di pulizia riproducibile, verificato tramite immagini Nano-CT e misurazioni di portata. La figura 3 illustra il flusso di lavoro per la produzione e il post-trattamento delle fasi stazionarie stampate.

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La porosità gerarchica migliora la separazione

Fig. 4: Cromatogramma della separazione dell’acido acetilsalicilico (1), del naftalene (2) e del fluorantene (3) su una fase stazionaria monolitica, gerarchicamente porosa, stampata nel corso del progetto. Le misurazioni sono state effettuate su un sistema Eksigent ExpressLC Ultra. La portata era di 20 µL/min, il volume di iniezione di 50 nL e le dimensioni della colonna utilizzata erano 6,0 × 0,35 mm (modificate in base a [7]).(Bild: Università di Reutlingen)
Fig. 4: Cromatogramma della separazione dell’acido acetilsalicilico (1), del naftalene (2) e del fluorantene (3) su una fase stazionaria monolitica, gerarchicamente porosa, stampata nel corso del progetto. Le misurazioni sono state effettuate su un sistema Eksigent ExpressLC Ultra. La portata era di 20 µL/min, il volume di iniezione di 50 nL e le dimensioni della colonna utilizzata erano 6,0 × 0,35 mm (modificate in base a [7]).
(Bild: Università di Reutlingen)

Oltre ai macropori definiti, è stata creata anche una struttura superficiale mesoporosa. Questa porosità gerarchica soddisfa due requisiti delle colonne di separazione cromatografica: I macropori di grandi dimensioni garantiscono una bassa resistenza al flusso, mentre i mesopori aumentano notevolmente la superficie specifica, migliorando così l’interazione tra l’analita e la fase stazionaria. Nel corso del progetto, i ricercatori hanno realizzato tali sistemi porosi in modo mirato e riproducibile.

I monoliti realizzati con la stampa 3D sono stati successivamente analizzati mediante cromatografia. Dopo la funzionalizzazione idrofobica con metacrilato di laurile, è stato possibile dimostrare per la prima volta, a livello sperimentale, la funzionalità in fase inversa. In condizioni di gradiente, è stata separata con successo una miscela composta da tre composti (cfr. fig. 4).

Prospettiva: sistemi LC realizzati interamente con produzione additiva

Fig. 5: A sinistra: disegno CAD del chip LC con le singole fasi di produzione: 1. Realizzazione della base; 2. Realizzazione della fase stazionaria; 3. Realizzazione del coperchio e dell’interfaccia. A destra: chip LC realizzato sul letto di stampa a confronto con una moneta da 1 centesimo.(Bild: Università di Reutlingen)
Fig. 5: A sinistra: disegno CAD del chip LC con le singole fasi di produzione: 1. Realizzazione della base; 2. Realizzazione della fase stazionaria; 3. Realizzazione del coperchio e dell’interfaccia. A destra: chip LC realizzato sul letto di stampa a confronto con una moneta da 1 centesimo.
(Bild: Università di Reutlingen)

A lungo termine, la visione va ben oltre le singole colonne di separazione. I partecipanti al progetto hanno già sviluppato un primo chip LC interamente realizzato con la produzione additiva, in cui i microcanali e la fase stazionaria vengono creati in un unico processo di produzione. Sebbene vi sia ancora margine di miglioramento per quanto riguarda il collegamento alle periferiche dei sistemi HPLC, il concetto dimostra il potenziale che la produzione additiva possiede per i futuri sistemi analitici integrati (vedi fig. 5).

Conclusioni e prospettive

I risultati del progetto 3DmiChrom dimostrano che la micro-stampa 3D basata sulla polimerizzazione a due fotoni in fase stazionaria è ben più di un semplice processo di produzione alternativo. Essa consente per la prima volta una progettazione digitale mirata della geometria dei pori, della chimica delle superfici e del comportamento dei flussi all’interno di monoliti cromatografici. Grazie alla realizzazione riproducibile di macropori fino a 1 µm, a monoliti polimerici gerarchicamente porosi e alle prime separazioni cromatografiche riuscite, è stata raggiunta una pietra miliare fondamentale per quanto riguarda i sistemi micro-LC interamente realizzati con produzione additiva.

A ottobre 2026 prenderà il via un progetto di follow-up dell’IGF. In particolare, le piccole e medie imprese (PMI) operanti nei settori della produzione in fase stazionaria e della produzione additiva sono invitate a partecipare alla prima riunione del comitato di accompagnamento del progetto. La riunione si terrà il 1° dicembre 2026 presso l’Institut für Umwelt & Energie, Technik & Analytik e. V. a Duisburg. In tale occasione verranno presentati i risultati del progetto concluso e verrà fornita una panoramica dei lavori di ricerca previsti e delle priorità del progetto successivo. La riunione offre inoltre l’opportunità di presentare le proprie esigenze e domande e di contribuire attivamente all’ulteriore sviluppo del progetto.

Ringraziamenti

Il progetto IGF n. 01IF22786N della F.O.M. è stato finanziato nell’ambito del programma di sostegno alla ricerca industriale collettiva (IGF) dal Ministero federale dell’Economia e dell’Energia (BMWE) sulla base di una delibera del Bundestag tedesco.

Bibliografia

Informazioni sull'autore

  • Dott. Thorsten Teutenberg 
    Responsabile del dipartimento “Analisi di ricerca e miniaturizzazione”, Istituto per l’ambiente, l’energia, la tecnologia e l’analisi e. V. (IUTA)
  • Tobias Drieschner 
    dottorando, Università di Reutlingen
  • Dott. Tobias Werres 
    ricercatore, Istituto per l’Ambiente e l’Energia, Tecnologia e Analisi e. V. (IUTA)
  • Martin Klaßen 
    Responsabile del dipartimento “Igiene ambientale e prodotti farmaceutici”, Istituto per l’ambiente, l’energia, la tecnologia e l’analisi e. V. (IUTA)
  • Björn Lang 
    assistente studentesco, Istituto per l’Ambiente e l’Energia, Tecnica e Analitica e. V. (IUTA)
  • Dott.ssa Anita Lorenz 
    Chimica alimentare, Università di Reutlingen
  • Prof. Dr. habil. Marc Brecht 
    Vicepresidente per la didattica, Università di Reutlingen
  • Prof. Dr. Günter Lorenz (†) 
    Professore di chimica, Università di Reutlingen
  • Prof. Dr.-Techn. habil. Dipl. Ing. Andreas Kandelbauer 
    Vicepreside per la ricerca della Facoltà di Scienze della Vita, Università di Reutlingen

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