Microfluidica automatizzata Un approccio più semplice per ottenere immagini ad alta risoluzione di numerose strutture cellulari

La microscopia a super-risoluzione rende visibili le disposizioni delle molecole con precisione nanometrica. Tuttavia, gli esperimenti multiplex complessi richiedono ancora molte ore di lavoro manuale. La microfluidica automatizzata semplifica questi processi, aumenta la riproducibilità e apre la strada alla microscopia intelligente.

Per decenni, uno degli obiettivi principali della microscopia è stato quello di raggiungere una risoluzione spaziale sempre maggiore. La moderna microscopia a super-risoluzione (SRM) ha ormai spostato questo limite fino a circa dieci nanometri. Ciò consente di rendere visibili strutture su scala nanometrica e l’organizzazione delle proteine, che non possono essere risolte con la microscopia ottica convenzionale.

Da una risoluzione più elevata a una maggiore quantità di informazioni biologiche

I sistemi biologici sono tuttavia complessi. Una cellula contiene numerosi organelli e strutture che interagiscono tra loro. La loro organizzazione spaziale è strettamente legata alla funzione cellulare. Per questo motivo, oggi i ricercatori non solo desiderano rappresentare le singole strutture con la massima nitidezza possibile, ma anche studiare il maggior numero possibile di componenti di una cellula o di un tessuto nelle loro relazioni spaziali reciproche.

La microscopia a super-risoluzione multiplexata è diventata così uno strumento fondamentale nell'imaging biologico moderno. Allo stesso tempo, però, si presenta una sfida pratica: più informazioni si desidera ricavare da un campione, più complesse diventano le procedure sperimentali – e più difficile diventa eseguirle manualmente.

DNA-PAINT consente il multiplexing molecolare

Nella microscopia a fluorescenza multicolore convenzionale, le diverse strutture vengono marcate con fluorofori di vari colori. Nella pratica, tuttavia, è possibile distinguere in modo affidabile solo un numero limitato di strutture bersaglio. 

DNA-PAINT adotta un approccio diverso: brevi sequenze di DNA codificano l’identità delle diverse molecole bersaglio. Sonde di DNA complementari, marcate con coloranti fluorescenti, generano quindi i segnali necessari per l’imaging ad alta risoluzione. L’aspetto fondamentale è che diverse strutture bersaglio possono essere visualizzate in successione utilizzando lo stesso colorante fluorescente. Ciò consente di aggirare molte delle limitazioni della microscopia multicolore convenzionale.

Nel cosiddetto metodo Exchange-PAINT, le sonde di DNA fluorescenti vengono introdotte una dopo l’altra nel campione e poi rimosse. In questo modo è possibile rendere visibili in successione numerose strutture all’interno dello stesso campione biologico. Il metodo offre quindi un’elevata flessibilità per gli esperimenti multiplex; tuttavia, la sua applicazione pratica diventa sempre più complessa all’aumentare del numero di strutture bersaglio da analizzare.

Il lavoro manuale diventa un collo di bottiglia

Ogni ciclo di acquisizione con Exchange-PAINT comprende l'aggiunta delle sonde di DNA, l'acquisizione dell'immagine e diverse fasi di lavaggio. Un esperimento multiplex richiede quindi numerosi cambi di soluzione e dura in genere diverse ore.

Se queste fasi vengono eseguite manualmente, richiedono un’attenzione costante. Eventuali variazioni nel pipettaggio, nel lavaggio o nei tempi di incubazione possono influire sulla riproducibilità e, in ultima analisi, anche sulla qualità dell’immagine. Allo stesso tempo, l’esecuzione manuale limita la produttività dei campioni.

Qui emerge una sfida fondamentale della microscopia moderna: mentre le tecnologie di imaging diventano sempre più potenti, molte procedure sperimentali continuano a basarsi sulla manipolazione manuale dei campioni. La loro automazione può quindi essere importante tanto quanto l’ulteriore sviluppo del microscopio stesso.

La microfluidica automatizza il flusso di lavoro di imaging

Per eliminare questo collo di bottiglia, abbiamo sviluppato una piattaforma microfluidica automatizzata per la microscopia a super-risoluzione multiplexata.

Anziché sostituire manualmente le soluzioni di imaging, i vari reagenti vengono convogliati attraverso canali fluidici separati e immessi nella camera del campione tramite un sistema controllato da software. Un delicato sistema di controllo dell’aria compressa consente un cambio rapido e riproducibile della soluzione, con un impatto minimo sul campione e un basso consumo di reagenti.

Anziché sostituire manualmente le soluzioni di imaging, i vari reagenti vengono convogliati attraverso canali fluidici separati e immessi nella camera del campione tramite un sistema controllato da software. Un delicato sistema di controllo dell’aria compressa consente un cambio rapido e riproducibile della soluzione, con un impatto minimo sul campione e un basso consumo di reagenti.

Il sistema è stato appositamente progettato come sistema aggiuntivo modulare e può essere integrato con le piattaforme di microscopia già esistenti. Per esperimenti più complessi, all’occorrenza è possibile aggiungere facilmente ulteriori canali fluidici.

Ciò comporta chiari vantaggi per l’attività quotidiana di laboratorio: maggiore riproducibilità, minor lavoro manuale, minore consumo di reagenti e una maggiore produttività. Soprattutto, i protocolli di imaging complessi possono essere eseguiti in modo standardizzato, senza che ogni singola fase debba essere eseguita manualmente.

Una sfida particolare: le cellule del muscolo cardiaco, particolarmente delicate

I vantaggi di un’apporto idrico controllato risultano particolarmente evidenti nel caso di campioni biologici sensibili.

I cardiomiociti primari sono grandi cellule del muscolo cardiaco che, in alcuni casi, aderiscono solo debolmente alla superficie della camera di campionamento. Il lavaggio manuale ripetuto può sottoporre le cellule a stress meccanico o addirittura staccarle dalla superficie. Per l’imaging multiplex, tuttavia, è necessario che la stessa cellula rimanga stabile per diversi cicli di acquisizione consecutivi.

La piattaforma microfluidica genera un flusso di liquido controllato con precisione e delicato. Ciò ha permesso di sostituire ripetutamente le soluzioni DNA-PAINT senza danneggiare i cardiomiociti durante l'esperimento.

Con questo approccio è stato possibile visualizzare cinque diverse strutture bersaglio all’interno dei singoli cardiomiociti. Le immagini a super-risoluzione ottenute mostrano la disposizione dettagliata su scala nanometrica delle proteine associate alla membrana all’interno della stessa cellula. Allo stesso tempo, i risultati evidenziano che la microfluidica automatizzata consente di ottenere immagini multiplex complesse anche con campioni biologici sensibili.

Dalla fluidica automatizzata alla microscopia automatizzata

Le possibilità offerte dall'automazione microfluidica vanno ben oltre lo scambio di sonde di DNA.

Poiché il sistema è controllato da software, il cambio di soluzione può essere integrato direttamente nell'acquisizione delle immagini. Il microscopio potrebbe innanzitutto acquisire la prima struttura marcata con fluorescenza e poi eseguire automaticamente le operazioni di lavaggio e la sostituzione della sonda di DNA prima di proseguire con l'acquisizione delle immagini.

In questo modo è possibile automatizzare non solo una singola fase di lavoro, ma, in prospettiva, l’intero flusso di lavoro sperimentale. Esperimenti complessi, che oggi richiedono un monitoraggio continuo da parte di utenti esperti, potrebbero essere eseguiti secondo protocolli standardizzati con un intervento manuale minimo. Ciò potrebbe rendere la microscopia a super-risoluzione multiplexata più facilmente accessibile anche a non specialisti, alle strutture di imaging centralizzate e agli studi su larga scala.

Il passo successivo consiste non solo nell’automatizzare tali flussi di lavoro, ma anche nel renderli adattivi. Le informazioni relative alle immagini acquisite durante l’esperimento potrebbero essere analizzate dal software e utilizzate per determinare la fase sperimentale successiva – ad esempio la regolazione dei parametri di acquisizione, la selezione di una nuova area dell’immagine o la sostituzione mirata di una soluzione.

Verso la microscopia intelligente

Una piattaforma molto promettente per tali flussi di lavoro è il microscopio a foglio di luce Flamingo.

Flamingo è stato concepito come piattaforma di imaging portatile, le cui componenti ottiche, hardware e software possono essere adattate alle diverse esigenze sperimentali. L’architettura modulare offre quindi una base adeguata per combinare la fluidica automatizzata con l’acquisizione di immagini e protocolli di microscopia adattivi.

La visione a lungo termine è quella di un microscopio intelligente in cui l’acquisizione delle immagini, la manipolazione dei campioni e l’analisi dei dati non siano più fasi separate. Al contrario, le informazioni ottenute durante l’acquisizione potrebbero guidare l’esperimento in tempo reale – ad esempio selezionando aree rilevanti dell’immagine, regolando i parametri di acquisizione o attivando un cambio di soluzione.

La microfluidica svolge un ruolo importante in questo contesto: non solo consente al microscopio di osservare un campione, ma anche di interagire con esso in modo mirato e di controllarne con precisione l’ambiente circostante.

L'automazione oltre la microscopia

Gli stessi principi possono essere applicati anche al di fuori della microscopia a fluorescenza multiplex. Gli esperimenti nel campo della nanotecnologia del DNA e dell’auto-organizzazione molecolare richiedono spesso l’aggiunta e la rimozione di componenti molecolari con precisione temporale. La microfluidica automatizzata può assumere questo controllo e, allo stesso tempo, ridurre il consumo di reagenti e aumentare la riproducibilità.

Concetti simili potrebbero risultare interessanti anche per nuovi approcci sperimentali all’intersezione tra nanotecnologia e scienze quantistiche, in cui gli ambienti chimici controllati con precisione e i processi sperimentali automatizzati rivestono un ruolo importante.

La microfluidica automatizzata è quindi ben più di una semplice soluzione per le operazioni ripetitive di pipettatura. Combinando la manipolazione controllata dei campioni con la microscopia controllata da software, diventa un elemento fondamentale per una nuova generazione di piattaforme sperimentali automatizzate e adattive.

Originalpublikation: Basak, S.; Chi-Vu, K.; Mougios, N.; Oleksiievets, N.; Pollack, Y.G.; Brandenburg, S.; Opazo, F.; Lehnart, S.E.; Enderlein, J.*; Tsukanov, R.*, “A versatile microfluidics platform for enhanced multi-target super-resolution microscopy”. ACS Nano, 20 (2026)