Organi su chip Test farmacologici più rapidi grazie alla bio-stampa 3D e all’automazione

I modelli tissutali miniaturizzati su chip microfluidici possono accelerare lo sviluppo di nuovi farmaci. A tal fine è fondamentale un processo di produzione automatizzato, pulito e riproducibile. Una collaborazione tra Festo, l’Università Tecnica di Darmstadt e la startup Black Drop dimostra come la biostampa, la microfluidica e il trasporto senza contatto possano essere integrati in un unico processo continuo.

Stampare facilmente organi miniaturizzati? Quello che sembra fantascienza è già realtà: la bio-stampa 3D è una tecnologia biomedica fondamentale per la produzione di tessuti viventi e organi miniaturizzati. In questo processo, le cellule biologiche vengono incorporate nei cosiddetti idrogel. Questa miscela è denominata «biotinta» e viene stratificata, strato dopo strato, in modo analogo alla stampa 3D convenzionale. Le strutture biologiche così ottenute possono essere impiegate in diversi campi di applicazione. La gamma comprende impianti biologici nel campo della medicina rigenerativa, carne prodotta in laboratorio come alternativa agli alimenti di origine animale e modelli di organi miniaturizzati che possono essere utilizzati per testare principi attivi. Questi ultimi sono particolarmente rilevanti per la ricerca biomedica. Quando tali mini-organi vengono realizzati su chip microfluidici, si parla di «Organs-on-a-Chip» (OOC). In futuro, questi dovrebbero essere utilizzati come sistemi di test più significativi nella ricerca farmaceutica.

Si preferisce il metodo “drop-on-demand” per gli “organs-on-a-chip”

La bio-stampa 3D comprende diverse tecnologie di stampa. Il processo “drop-on-demand” è particolarmente indicato per la produzione di compositi multimateriale e per la stampa di piccole strutture tissutali (ad es. OOC) su chip microfluidici. Analogamente a quanto avviene con una stampante da scrivania in ufficio, in questo processo di stampa senza contatto singole gocce di bio-inchiostro vengono espulse a una determinata distanza e trasferite sulla superficie da stampare. Rispetto ad altri processi, come la microestrusione o la stereolitografia, questo processo si distingue per l’ampia gamma di materiali nella fascia di viscosità da bassa a media, dalla tensione di spinta dell’ugello controllabile e dal trasferimento del materiale senza contatto, che favorisce la stampa di cavità o superfici irregolari.

Modelli più efficaci per la pipeline di scoperta di nuovi farmaci

Lo sviluppo di nuovi farmaci segue un processo articolato in più fasi, denominato “pipeline di scoperta dei farmaci”. All’identificazione e all’ottimizzazione di promettenti candidati farmaci seguono test preclinici su colture cellulari e su modelli animali, prima che abbiano inizio gli studi clinici sull’uomo. Proprio il passaggio dai modelli preclinici all’applicazione clinica è fondamentale. Le classiche colture cellulari e i modelli animali riproducono la fisiologia umana solo in misura limitata e sono quindi poco significativi per valutare l’efficacia sull’uomo. Su cinque candidati farmaci testati sull’uomo, in media solo uno ha esito positivo e ottiene l’autorizzazione all’immissione in commercio. Gli altri quattro candidati vengono definiti «late fails»: falliscono in una fase avanzata del processo, dopo che sono già stati investiti molto tempo e denaro.

Gli "organs-on-a-chip" intervengono proprio in questo punto della pipeline. Combinano cellule umane, strutture tissutali tridimensionali e canali microfluidici, all’interno dei quali è possibile convogliare in modo controllato terreni di coltura e principi attivi. Ne risultano piccoli sistemi di test simili a organi che riproducono determinate funzioni dei tessuti umani in modo più realistico rispetto alle colture cellulari statiche o alla sperimentazione animale. Nello sviluppo dei farmaci, tali sistemi possono aiutare a valutare l’efficacia e gli effetti collaterali in modo più precoce e attendibile. In questo modo, in futuro i nuovi farmaci dovrebbero essere sviluppati più rapidamente e a costi inferiori.

Stato dell'arte: promettente, ma ancora fortemente manuale

I sistemi “organ-on-a-chip” vengono oggi realizzati principalmente in ambienti di laboratorio specializzati. Innanzitutto viene preparato il chip microfluidico, dopodiché vengono introdotte cellule o idrogel carichi di cellule tramite la biostampa 3D. Seguono poi ulteriori fasi del processo. Le strutture stampate devono essere stabilizzate, i canali sigillati, il terreno di coltura introdotto e le cellule coltivate in condizioni controllate. Per i modelli funzionali è inoltre spesso necessaria la perfusione, ovvero il lavaggio continuo dei canali con un fluido.

Questa catena di processo è in linea di principio possibile, ma nella pratica è spesso ancora caratterizzata da fasi di lavoro manuali. Il personale di laboratorio posiziona i chip, applica gli elementi di copertura, collega i circuiti fluidici, inserisce le cannule o trasferisce i sistemi in ambienti di incubazione. Ciò richiede esperienza e accuratezza, ma limita la riproducibilità, la produttività e la scalabilità. È proprio a questo punto di incontro tra fattibilità biologica e processo industrialmente gestibile che si inserisce il lavoro di sviluppo congiunto di Festo, TU Darmstadt e Black Drop.

Un nuovo chip come fulcro della catena di processo automatizzata

Al centro del lavoro di sviluppo c’è un chip microfluidico di nuova concezione. Esso non solo funge da supporto per il futuro modello tissutale, ma costituisce anche l’interfaccia centrale per l’automazione. Le sue strutture canalari, le superfici di tenuta e i raccordi per i fluidi sono progettati in modo tale che la stampa, la sigillatura, il riempimento e la successiva coltura possano essere integrati in una catena di processo continua e completamente automatizzata.Il chip si basa su un collettore saldato per diffusione (Diffusion-Bonded-Manifold) con strutture fluidiche precise e integrate. Ciò consente di distribuire i terreni di coltura in modo controllato e di organizzare l’apporto alle cellule in modo mirato. Per gli «Organs-on-a-Chip» questa integrazione è fondamentale. Solo quando tessuti, canali, guarnizioni, conduzione dei fluidi e interfacce di processo si integrano perfettamente, un complesso cellulare stampato diventa un sistema di test riproducibile.

Dalla biostampa al sistema di test chiuso

La stampante biologica trasferisce cellule vive sul chip microfluidico tramite la tecnologia “drop-on-demand”. Le cellule sono incorporate in un idrogel e vengono dosate con precisione in goccioline molto piccole. Successivamente, il materiale viene reticolato con luce UV, affinché la struttura stampata sia sufficientemente stabile per le fasi successive del processo.

Dopo la biostampa, si passa dal processo di stampa a cielo aperto al sistema microfluidico chiuso. I canali esposti e la camera contenente le cellule stampate vengono coperti con una piastrina di vetro rivestita di silicone. In questo modo si crea uno spazio definito per i fluidi, in cui le cellule possono essere alimentate, perfuse e coltivate in vista di test successivi.

Trasporto senza contatto nel processo

Un elemento fondamentale del lavoro di sviluppo è il trasporto senza contatto del chip microfluidico. A tal fine, il chip poggia su un vettore sospeso, che viene spostato da una stazione all’altra grazie alla tecnologia Supra-Motion di Festo. Il sistema cinematico può rimanere all’esterno della camera bianca; il trasporto avviene senza contatto meccanico e senza dispersione di particelle. Per le applicazioni nel campo delle scienze della vita, ciò facilita la pulizia, protegge i campioni sensibili e garantisce processi affidabili in ambienti simili alle camere bianche.

Automatizzare significa: rendere controllabili le fasi del processo

L’automazione non si limita alla stampa delle cellule, ma comprende anche le fasi successive, fondamentali per il corretto funzionamento di un sistema “organ-on-a-chip”. Tra queste figurano la copertura e la sigillatura precise del chip, l’immissione del terreno di coltura, la preparazione della perfusione e il trasferimento in sicurezza in un ambiente di incubazione. Sono proprio queste fasi, apparentemente secondarie, a determinare se un modello biologico possa essere coltivato in modo affidabile nel tempo.

Nel processo illustrato, tre cannule penetrano nel chip attraverso una membrana in silicone. Una cannula genera una depressione per mantenere la piastrina di vetro in posizione e sigillare in modo sicuro i canali. Attraverso altre due cannule viene immesso il terreno di coltura. Una volta riempito, gli aghi vengono nuovamente rimossi; i fori si chiudono autonomamente grazie alla membrana stessa. Il chip può quindi essere trasferito in modo sterile e sicuro alle fasi successive del processo.

La riproducibilità come presupposto per un utilizzo più diffuso

La novità del lavoro di sviluppo risiede quindi non tanto in una singola fase isolata del processo, quanto piuttosto nell’integrazione dell’intero flusso di lavoro. La biostampa, la fluidica, la tenuta, l’alimentazione dei fluidi, il trasporto, la tecnologia di controllo e il software vengono combinati in modo tale che da una sequenza di operazioni manuali di laboratorio possa nascere un processo automatizzato e riproducibile.

Per la tecnologia medica e la ricerca farmaceutica si tratta di un passo decisivo. Se in futuro si vorrà diffondere l’uso dei sistemi “organ-on-a-chip”, la loro produzione e il loro funzionamento dovranno non solo essere biologicamente validi, ma anche documentabili, ripetibili e scalabili. L’automazione riduce la variabilità manuale, stabilizza i parametri di processo e facilita il trasferimento di tali sistemi dalla ricerca all’applicazione pratica.

Prospettive: dalla dimostrazione all’applicazione

Grazie alla collaborazione tra Festo, l’Università Tecnica di Darmstadt e Black Drop è stato realizzato un impianto pilota che, per la prima volta, riproduce la produzione automatizzata di “organs-on-a-chip” come processo integrato. Questo impianto sarà ora oggetto di ulteriori studi scientifici. L’attenzione è rivolta alla comprensione del processo, alla riproducibilità, alla qualità del modello e alla trasferibilità a diverse applicazioni. Su questa base, la fase successiva prevede lo sviluppo di un sistema commerciale completamente automatizzato che avvicini gli «Organs-on-a-Chip» dall’ambiente di laboratorio specializzato a un’applicazione più ampia nella ricerca, nello sviluppo di principi attivi e nella biomedicina.

Passaggi decisivi in questo contesto sono l’integrazione di una camera di coltura (incubatrice) e di ulteriori sensori in linea per il controllo del processo. In questo modo si crea un ambiente di processo misurabile e standardizzabile, fondamentale per i futuri studi di validazione. Una sfida è rappresentata dal collegamento del processo di stampa con la coltura cellulare a monte. Per poter utilizzare l’impianto automatizzato a piena capacità, le cellule devono essere prodotte in quantità sufficientemente elevate e, idealmente, trasferite automaticamente nella stampante. Infine, sono rilevanti i metodi di analisi a valle che monitorano la qualità dei modelli tissutali dopo la stampa e durante la coltura. Una volta implementati anche questi, sarà possibile ottenere una produzione e un controllo di qualità degli OOC completamente automatizzati.